将DNA或RNA模板与引物以及荧光探针一起加入PCR反应体系中。PCR的扩增过程会在每个PCR循环中复制目标分子的数量。该过程包括热变性（解链）、引物结合和延伸。如果探针与靶分子结合，则荧光信号会在PCR反应过程中产生。在PCR反应过程中，荧光信号会在每个循环中累积。通过实时测量荧光信号的强度，可以判断PCR反应的进程和扩增产物的数量。经过一系列计算和标准曲线校准，可以定量目标分子的起始数量。